酵母表面展示系统的优化策略
发布时间:2024-06-16 06:24:36 来源:okooo手机网 作者:澳客竞彩YSD技术应用广泛,如蛋白质工程或多肽、全细胞生物催化、疫苗生产、抗体/纳米纳米生产、生物燃料生产、生物燃料电池和全蛋白质组研究。
酵母表面展示(YSD)是一个“全细胞”平台,用于将异源蛋白质固定在酵母细胞表面的表达。YSD具有真核系统的优势,如翻译后修饰、正确折叠和糖基化,易于细胞培养和遗传操作。并且酵母表面展示的蛋白质对温度、pH值、有机溶剂和蛋白酶具有较高的稳定性,同时酵母细胞还适用于流式技术。因此,YSD被大范围的使用在研究蛋白质-蛋白质相互作用、抗体设计和蛋白质工程包括文库筛选、全蛋白质组研究、疫苗和抗生素的开发、生物传感器的生产等。本期文章为大家介绍提高酵母表面展示效率的优化策略。
YSD技术是通过将目的蛋白与锚定蛋白相融合实现的。YSD与其他类似展示系统相比的优点包括:1.各种酵母菌株(酿酒酵母、毕赤酵母和解脂耶氏酵母)具有美国食品和药物管理局(FDA)的“公认安全”(GRAS)属性;2.酵母细胞可以有效的进行线.容易进行细胞培养和基因操作,能够正确折叠和分泌大而复杂的蛋白质;4.酵母表面展示与流式细胞仪分析的适配性。
当将可溶性蛋白或多肽展示于细胞表面时,它们获得了可溶性状态所不具备的生物技术优势,比如容易复性、控制蛋白质的空间取向、与共展示蛋白质相互作用以模拟超分子复合物和易于细胞分选。该系统的另一个重要优势是可耦合酵母代谢与酵母细胞表面蛋白质的功能。有关YSD技术原理详细的介绍可参看往期文章《酵母表面展示与噬菌体展示在纳米抗体研发中大比拼》。
控制酵母表面展示的调控和结构元件,通过构建在表达质粒中或整合到酵母基因组中,以获得更稳定的遗传背景。
合成酵母质粒是用于受控异体蛋白表达的染色体外遗传元件,设计用于在启动子、终止子、转录因子等调控序列的控制下驱动基因表达。其基因表达水平受到质粒拷贝数的影响,同时也受到启动子强弱的影响,组成型启动子和诱导型启动子都可用于蛋白展示质粒的构建。在酿酒酵母最常用的蛋白表达启动子是半乳糖启动子(GAL1/GAL10),在毕赤酵母中常用GAP和AOX1启动子,在解脂耶氏酵母中则是TEF1和hp4d启动子。
锚定蛋白的选择对酵母表面展示效率至关重要,主要由目的蛋白的应用和特性决定。最常见的锚定蛋白是依赖细胞壁蛋白在靶蛋白和细胞壁β-1,6葡聚糖之间提供一个共价键。Aga1-Aga2锚定蛋白,最初由Boder和Wittrup开发,已用于几种蛋白的表达,允许蛋白质通过其N端或C端固定化。此外,锚点长度也是主要的因素,因为与短锚点融合的目的蛋白有几率存在展示活性位点的空间位阻,进而影响配体-受体的相互作用。图1描述了常见锚和修改后的锚。一些锚,如Aga1-Aga2,允许蛋白质通过其n端或c端固定。目的蛋白的最佳取向也影响配体的结合亲和力。
锚定蛋白的信号肽序列的修饰对目的蛋白的展示水平的提高有重要影响。通常使用天然信号肽,即a-凝集素,SED1p, Pir1p和Flo1p已被证明使用其自身的信号肽可提供良好的蛋白表达水平。关于信号肽定向进化的研究表明,信号肽序列中疏水核心的变化明显影响蛋白质分泌。
锚点长度是另一个需要仔细考虑的主要的因素,因为与短锚点融合的目的蛋白可能表现出活性位点的空间位阻,影响配体-受体的相互作用。在锚蛋白和目的蛋白之间常见的短序列称为连接子或间隔子。连接子是O-糖基化区域,它保护蛋白免受蛋白酶的降解。连接子的基本功能是降低GPI融合对目的蛋白活性的影响。富含Ser/ Thr和(G4S)3连接序列是最广泛使用的。据报道,连接子的存在通过保留活性位点的构象和底物对展示在酵母细胞外表面的目的蛋白的可及性来提高目的蛋白的展示效率和活性。增强锚点长度以及在锚点和目的蛋白之间添加连接子对展示蛋白的可及性有积极影响。Yang等人(2019年)通过将目的蛋白与Aga1p的N端融合,并在目的蛋白和锚点之间加入一个灵活的连接体,包含17个由Ser和Gly重复序列组成的氨基酸,重建了a-凝集素(Aga1-Aga2)。这种修饰显示了更高的展示效率,并可能更适用于较大的蛋白质或蛋白质复合体的展示(Yang et al., 2019 )。
酵母菌株的基因组和代谢背景是影响天然或外源蛋白进行酵母展示的重要条件。合成生物学方法与基因组编辑技术相结合,开发出具有微调外源蛋白表达的酵母菌株。新的酵母展示菌株是经过仔细修改其天然特征,如其细胞壁组成或其蛋白分泌途径。酿酒酵母菌株,主要是EBY100(ATCC MYA-4941)和BY4741已成功作为酵母展示菌株。此外,为了获得优化的体系,还可对其他酵母菌株做评估,例如酿酒酵母(AWY100, AWY101, AWY102)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、多态汉森菌(Hansenula polymorpha)和布拉酵母(Saccharomyces boulardii)等。
提高蛋白质展示效率是优化酵母表面展示的关键一环,但是要想提供整体系统的高效筛选,使用可便捷检测蛋白展示水平的方法同样至关重要。例如,GFP已经展示出高性能的酵母展示库对葡萄糖氧化酶的高通量筛选(Kovačević et al., 2019)。而Uchański等人开发出适合用于纳米抗体文库筛选的YSD平台,他们的研究小组将纳米抗体融合到Aga2p的N端以避免空间位阻,并利用荧光基团进行纳米抗体检测,该荧光基团通过Sfp合成酶催化的一步反应连接到蛋白标签上(Uchański et al., 2019)。
YSD技术应用广泛,如蛋白质工程或多肽、全细胞生物催化、疫苗生产、抗体/纳米纳米生产、生物燃料生产、生物燃料电池和全蛋白质组研究。
关于YSD在抗体发现和蛋白改造中的应用可参看往期文章《酵母表面展示技术在抗体发现中的应用》,《酵母表面展示技术在蛋白改造中的应用》。
除此之外,通过YSD技术已成功开发出抗念珠菌病疫苗和动物疾病相关疫苗,包括抗弓形虫疫苗、抗草鱼出血性疾病疫苗和抗蜱疫苗。其他相关应用包括用于检测血液生化参数的生物传感器,疏水蛋白的表达和抗生素的开发。
在食品行业中,YSD技术可用于固定表达合成相关化合物的酶,以生产甜味剂,如异麦芽糖和低聚果糖,生产有益脂肪,如Ω-3脂肪酸。全细胞生物催化剂已被用于改善包括啤酒和葡萄酒在内的饮料的口感。在农业应用中,YSD技术可用于开发生物防治剂,增强生物抗感染能力。
在生物燃料生产领域,YSD技术能利用酵母将糖类发酵成乙醇的代谢能力和固定在酵母表面的水解酶的活性,使得纤维素糖化和乙醇发酵的同时进行,以实现统一的生物加工。
自第一个酵母表面展示系统开发以来,该平台已逐渐在多个领域得到普遍应用;并且发展出来不同的策略用于改善这样的平台上目标蛋白的生产和检测。此外,酵母表面展示系统与代谢或蛋白质工程的兼容性为引入数据库和预测软件提供的新平台提供了巨大的机会。现有的优化策略为今后获得最佳的酵母表面展示性能夯实了前进道路的基础。
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