弗氏彻底佐剂（或弗氏不彻底佐剂）能用两个打针器在无菌条件下进行乳化，随后只需求其他加上皮下打针针头进行打针。

  (1) 核算每次打针所需抗原的量和体积。皮下打针或肌肉打针时，每只小鼠每次 5〜I00ug 抗 原 ，打针体积小于 20uL; 腹腔内打针时，每只小鼠每次打针体积为 200〜500ul。强洗涤剂会削弱乳化效应, 需防止。预备大约比终究所需量多 50% 的 疫 苗 。

  (2) 依据所加资料的总体积挑选针筒。佐剂和抗原的总体积应大约为针筒体积的一半 。例 如 ，预备 2.5ml 的疫苗时，用 5ml 的针筒进行乳化。

  (3) 使 用 前 37℃预热弗氏彻底佐剂（或弗氏不彻底佐剂），振 荡 1〜2 min 或用手倒转瓶子数次，将结核分枝杆菌均匀重悬。汲取所需体积的弗氏彻底佐剂或弗氏不彻底佐剂到针筒内，衔接针筒到双孔接头，排出空气 (过量空气将阻碍安稳的乳化剂的构成）。

  (4) 汲取水溶性抗原到另一针筒，排出空气（过量空气可阻碍安稳的乳化剂的构成）。

  (5) 将有抗原的针筒连在双孔接头的一端。确认两个针筒均经 Luer-lock 安全地固定在双孔乳化接头上。

  (6) 平稳地推进活塞，使一切的抗原溶液穿过双孔接头与弗氏彻底佐剂或弗氏不彻底佐剂混合。彼此替换，持续使混合物从一个针筒转到另一个 。

  (7) 按上述进程持续乳化，直到安稳的乳化剂构成。这将需求数分钟。推出一小滴乳化剂到盛有水的烧杯内，小乳滴应该在水面构成安稳的油珠。假如乳剂滴人水面涣散，从头拼装针筒，持续乳化。

  (8) 将一切乳化剂推人一个针筒。拔去双孔接头，加上打针针头。其他可挑选将空针筒拔去，换 上 1ml 无菌针筒。此刻，乳化剂可转入 1ml 针筒以备打针

  (1) 核算每次打针所需抗原量及体积。皮下打针或肌肉打针时，每 只 小 鼠 每 次 5〜100ug ，少 于 200uL。腹腔内打针时，每只小鼠每次 200 〜500uL。洗涤剂会削弱乳化效果，应防止。预备大约比所需量多 50 % 的疫苗。

  (2) 使 用 前 37℃预热弗氏彻底佐剂或弗氏不彻底佐剂，激烈振动 1〜2 min，或用手倒转瓶子数次将结核分枝杆菌均匀重悬。将弗氏彻底佐剂与等体积的水溶性抗原转入一无菌聚丙烯管中。

  (3) 超声处理可发生很多热，会导致蛋白质抗原变性。为防止混合物过热，在超声中或空隙将聚丙烯管置于冰上。每 次 间 歇 5〜20s ，上下调理管的高度，保证整个混合物均匀乳化。留意操作时佩带耳塞。

  (4) 倒转聚丙烯管以确认乳化剂的稠度。持续乳化，空隙 10s，直到安稳的乳化剂构成 。当乳化剂在倒转的管中不动或在水面上构成安稳的油珠时，乳化即可完结。

  (5) 将乳化剂吸人 1ml 打针器，或 者 用 Spack 和 Toaves 的 [18] 搬运技能将乳化剂转人 1ml 打针器内，具体进程如下：从一个打针器上取出无菌推芯，芯头的巨细与乳化剂地点的管内直径共同。乙醇擦洗管底以灭菌，然 后 用 灭 菌 的 18 号针头在管底穿孔，抓住一个已拔出推芯的 1ml 无菌打针器顶部直接对准乳化剂管底的洞，用上述巨细适宜的无菌推芯将管内乳化剂从管底推人 1ml 打针器。

  两 个 3ml 全塑胶打针器 (橡胶活塞会黏住打针器筒）或经硅化的全玻璃带 Luer-lock的打针器

  (2) 制备 1ml 乳化剂：一个打针器吸人 0. 5 ml TiterMax，另一个打针器吸入0.25 ml水溶性抗原。洗涤剂将会削弱乳化效应，应防止。留 0.25m l 水溶性抗原备用。

  (3) 将两个打针器都连上三通活塞，乳化第一步是把水溶性抗原推入 TiterMax 中，这步很重要。用力重复抽吸乳化剂，使其经过三通阀，约 2 min。

  (4) 将一切乳化剂压人一个打针器，取下空打针器。空打针器吸人余下的0.25ml 水溶性抗原。

  (5) 再将打针器装上，把水溶性抗原推入之前的乳化剂中，重复乳化进程 60s。

  (7) 推出一小滴滴到烧杯内水面上，以检测乳化剂的安稳性。假如小乳滴在水面变平或分散，将打针器重装上三通活塞，持续乳化，直至安稳的乳化剂构成，这样的一个进程大约需求数分钟

  (1) 使 用 RAS，主张抗原浓度为 50〜500 ug/ml，溶于盐溶液（PBS)。某些抗原需求用洗涤剂以添加其溶解度。在这种情况下，尽量将洗涤剂的终浓度控制在0.2 % 以下。

  (2) R A S 是以分装管出售的一种浓缩液，各免疫刺激剂的每管含量均为 500 ug 。每管能与含抗原的盐溶液从头组成终体积为 2ml 的混合液。使 用 前 37〜45℃ 水浴或温箱孵育约10min，这将促进下一步油与抗原溶液的混合。

  (3) 直接打针 2ml 抗原溶液到瓶中，剧 烈 振 荡 2〜3 min(单 磷 酸 类 酯 A 、海藻糖二霉菌酸酯，以及分枝杆菌细胞壁成分等各抗原刺激剂在抗原-佐剂乳化剂中的终浓度将为250ug/ml。

  或许，假如一瓶佐剂暂时不需悉数运用，可 用 1ml PBS 或盐水（不含抗原）稀释一瓶RAS，剧烈振动。用一无菌打针器和 22 号针头，汲取所需体积的佐剂，与等量的含抗原的盐水混合，剧烈振动混匀。剩 下 的 未 使 用 的 部 分 可 4℃ 保存 ，数月内安稳（使 用 前 37℃预热）。

  注 意 ：用 RAS制成的抗原-佐剂乳化剂不像弗氏佐剂或 TiterMax 制成的乳剂那么黏稠 ，它滴到水面上会轻易地散开。

  a. 小鼠：总剂量 0.2 ml，分两点皮下打针 (0.1ml/点），或总量 0.2ml 腹腔内打针。

  b.大鼠或豚鼠：总剂量 0.5 ml，分两点皮下打针 (0.2 ml/点），0.1ml 腹腔内打针。

  c. 兔 ：总剂量 1ml，0.3 ml/点 ，分别在两只大腿肌打针，0.1ml 颈后皮下打针 ，余下0.3ml 于其他部位弥散打针。

  (2) 用一无菌塑胶打针器将适量体积的 Gerbu 佐剂转入盛有抗原的管中，简略混匀。

  (3) 抽吸抗原-佐剂溶液到一打针器内，适量打针人免疫动物体内（所述仅为佐剂体积）。

  (1) 核算所需抗原量，无菌操作转入一个有无菌拌和子的无菌烧杯中，将烧杯放在拌和器上拌和。

  (3) 盖上烧杯，室温混合该混合液 30min，以保证抗原有用吸附于铅离子上。

  求助:抗原粉末状时分-20度保存，溶液不彻底弗氏佐剂平常4度保存。那么把他俩混合一同，应该放在多少度保存？大约能保存多久？